【科研】PNAS：分子小、反应快且具可逆性的新荧光标记

1月19日PNAS上的研究文章介绍了一种新的黄色荧光激活和吸收转换标签（Y-FAST）。它是一个小的单体蛋白的标记，只有绿色荧光蛋白的一半那么大。具体通过对细胞渗透的活化和无毒荧光配体可逆结合，使荧光标记是可逆的。基于两个光谱变化的独特荧光团激活机制，增加了荧光量子产率和红移吸收，提供了高选择性标记。Y-FAST是从14 kDa的光敏黄色蛋白，利用定向进化、酵母显示和荧光激活细胞分选改造而来。Y-FAST与普通荧光蛋白一样明亮，具有良好的耐光性，并允许在各种细胞器和宿主的蛋白质中有效标记。Y-FAST区别于其他标签系统的是由于荧光团的结合是高度动态的、完全可逆的，通过荧光团的加入和退出让蛋白质快速标记和除去标签，为基于序列标注的复合成像操作发展开辟了新的前景。

1.需求与缺陷

破译控制细胞和生物体复杂的机制需要有效的成像系统和荧光探针，来实时观察高时空分辨率的生物分子。理想的荧光探针对它们的目标应该是高度特异性的、明亮、光稳定、无毒和尽可能小，以避免干扰它们的目标。它们还应表现出瞬时强大的荧光，并提供了调整的可能，将系统的荧光复杂成像。

荧光蛋白GFP已经彻底改变了细胞生物学，对任何目标蛋白质提供具有绝对特异性基因融合的简单方法。然而，越来越多的研究表明，他们并不总是最优的可视探针：（1）因为它们的大小和可能导致不正常的融合蛋白的趋势；（2）它们的氧依赖性荧光排除其用于厌氧生物；（3）长成熟（1小时）难做到快速过程实时监控；（4）及它们与光开关，点亮，暗态转换等光物理过程混杂显示，从而干扰一些实验。

2. Y-FAST的原理

该研究开发的黄色荧光激活和吸收转换标签（Y-FAST），可以对在活细胞和多细胞生物中的蛋白进行荧光标记。Y-FAST是一个精心设计的14 kDa的光敏黄蛋白（PYP）单体的变体，它是来自盐芥的蓝色光的感光体，可以和 4-hydroxybenzylidene-rhodanine（HBR）或4-hydroxy-3-methylbenzylidene-rhodanine（HMBR）可逆结合。HBR和HMBR本身不发荧光，但当它们和Y-FAST结合，受蓝色光激发后发出黄光荧光。

Y-FAST区别于现有的标记因为结合不仅是特定的和瞬时的，但也是高度动态的，完全可逆的。因此荧光可以通过简单地加入或去除荧光试剂迅速切换和关闭，这提供了一个额外的程度控制。快速结合动力学可能会减少通过连续更新的荧光团带来的、以前的报告中提出过的光漂白速率。

具有挑战性的是，作为一个快速交换动力学的高速率所需的倾向需降低高选择性的亲和力。因此，该研究依靠双光谱对于荧光激活的变化保持高选择性：首先， H（M）BR结合Y-FAST显著增加荧光量子产率，二，诱导大的吸收红移。因为Y-FAST是推动这两个光谱变化的唯一种类，自由或非特异性结合的荧光团不会有助于产生荧光信号，确保了高成像对比度。

3. Y-FAST的优点

源于Y-FAST的亮度和成像稳定性，能够在多个体系如哺乳动物细胞（包括神经元）到细菌（大肠杆菌，沙门氏菌等），包括斑马鱼中运用。由于其分子小，不容易出现如GFP蛋白在密集环境（如膜系统）的低聚反应。所以Y-FAST是GFP的很好的替代品。

不像GFP那样，Y-FAST是立即荧光显色的。这可以让Y-FAST可以检测早期启动子变化；标记半衰期短的蛋白和实时监测转化和折叠事件。

调节了荧光团浓度后，Y-FAST也可以定量比较细胞器表达蛋白的拷贝数。

由于Y-FAST的标记是完全可逆的，这为不同目标的复合成像提供了机会。第一个标记染色成像后，标记通过物理或化学的方式移除，即可以进行对第二个不同目标的标记。Y-FAST甚至可以对CRISPR-Cas9基因标记的目标基因组实时监测。

在这项工作中开发的策略是为智能探针和生物传感器的设计开辟新的路线。特别是，HMBR属于一个系列的共轭体−受体化合物表现出不同的光物理和光化学行为，这在复合生物成像和生物传感上，可以方便的收集FASTs覆盖整个可见光谱的各种应用。

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